溫度循環(huán)參數(shù)：

1．變性溫度與時間

PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第1個循環(huán)變性重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。

2．復性溫度與時間

變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復性溫度在55℃左右。確定了復性溫度后，復性時間并不是關(guān)鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。

3．延伸溫度與時間

引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產(chǎn)物的特異性，也會影響其產(chǎn)量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達2kb的擴增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴增，延伸時間要長些。

4．循環(huán)數(shù)：

循環(huán)數(shù)決定著擴增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達到有效的擴增量。