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產(chǎn)品詳情
  • 產(chǎn)品名稱:黑麥草腥黑粉菌探針法熒光定量PCR

  • 產(chǎn)品型號(hào):PR4838
  • 產(chǎn)品**:博湖
  • 產(chǎn)品文檔:
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簡單介紹:
黑麥草腥黑粉菌探針法熒光定量PCR公司正在出售的產(chǎn)品:人分泌型卷曲相關(guān)蛋白2ELISA試劑盒 Recombinant Human TRIAD3A 溶質(zhì)載體家族25成員2封閉多肽 阻抑素/腫瘤抑制因子抗體Capan-1-LUC人胰腺癌細(xì)胞 Capan-1-LUC人胰腺癌細(xì)胞
詳情介紹:

商品貨號(hào)

PR4838

英文名稱

Tilleiia walkeri Castl

商品名稱

黑麥草腥黑粉菌

產(chǎn)品分類

熒光定量PCR

規(guī)格

50T

包裝

盒裝

用途

僅供科研研究實(shí)驗(yàn)

保存

-20℃避光

PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟:


?準(zhǔn)備階段?:
黑麥草腥黑粉菌探針法熒光定量PCR在PCR管上做好標(biāo)記,并將其置于冰上或低溫金屬塊上。
按照所使用的PCR酶說明書上的體系配制反應(yīng)預(yù)混液。這是一種具有高特異性及優(yōu)良擴(kuò)增性的高保真DNA聚合酶,適用于簡單或復(fù)雜模板、短片段或長片段的PCR擴(kuò)增,并添加了單克隆抗體以在常溫條件下抑制DNA polymerase活性,允許在常溫下配制預(yù)混液。
配制反應(yīng)液時(shí),按照順序添加RNase free water、10×PCR Buffer、dNTP Mix、引物,后加入DNA聚合酶。注意模板需在模板區(qū)加入。
預(yù)變性處理?:
將待檢測的DNA樣品與緩沖液混合,加入引物和dNTPs,然后在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行預(yù)變性處理,使DNA雙鏈解開。
PCR循環(huán)?:
加入DNA聚合酶和熒光染料,在變性、復(fù)性、延伸的溫度循環(huán)中完成DNA的擴(kuò)增。
通過熒光信號(hào)的讀取和分析,得出待檢測DNA樣品的濃度和序列信息。
結(jié)果分析?:
PCR技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和高分辨率等優(yōu)點(diǎn),能夠檢測出微量的DNA,并準(zhǔn)確地檢測出DNA序列的變異和突變。
結(jié)果分析方法包括定量和相對(duì)定量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法進(jìn)行分析。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,需要注意試劑的配制順序、酶的使用條件、模板的添加量以及引物的濃度,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。此外,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段需要充分考慮實(shí)驗(yàn)原理、操作流程、設(shè)備和試劑的選擇,以及實(shí)驗(yàn)記錄的詳細(xì)性,這些都是保證實(shí)驗(yàn)成功和結(jié)果可靠的關(guān)鍵因素?。



實(shí)驗(yàn)流程:


1. 配制PCR反應(yīng)體系:
- 模板DNA:10-100 ng(取決于模板的復(fù)雜性和豐度)
- 引物F(正向):0.1-1.0 μM
- 引物R(反向):0.1-1.0 μM
- dNTPs(混合的dATP、dCTP、dGTP、dTTP):0.2 mM each
- 10×PCR緩沖液:1×
- MgCl2:1.5-2.5 mM(根據(jù)酶的要求調(diào)整)
- DNA聚合酶:0.5-2.5 U(根據(jù)酶的活性調(diào)整)
- 無菌去離子水:補(bǔ)足至總體積(通常為20-50 μL)

2. 設(shè)置PCR程序:
- 初始變性:95°C,3-5分鐘(激活聚合酶)
- 變性:95°C,15-30秒(每個(gè)循環(huán))
- 退火:50-65°C,15-30秒(根據(jù)引物Tm調(diào)整)
- 延伸:72°C,30-60秒/kb(根據(jù)目標(biāo)片段長度調(diào)整)
- 終延伸:72°C,5-10分鐘
- 保存:4°C
3. 執(zhí)行PCR:
- 將配制好的反應(yīng)體系放入PCR儀器中,啟動(dòng)程序。
4. 電泳分析:
- PCR結(jié)束后,取少量反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,以驗(yàn)證擴(kuò)增效果。
5. 結(jié)果判斷:

- 觀察電泳結(jié)果,目標(biāo)條帶應(yīng)清晰可見,無非特異性擴(kuò)增。

PCR操作流程及注意事項(xiàng):


一、試劑準(zhǔn)備階段
試劑準(zhǔn)備是 PCR 操作的個(gè)流程,需要在試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)的超凈工作臺(tái)或生物柜進(jìn)行,用確保無污染的移液器、槍頭及容器等進(jìn)行分裝。所有的 PCR 體系都應(yīng)該在 - 20℃ 保存,除了 ddH2O 之外,其余的試劑組份需完全融化之后再加入,以免影響濃度。配制反應(yīng)體系應(yīng)在快速進(jìn)行,以減少非特異性擴(kuò)增。體系配制完成之后應(yīng)馬上進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。
二、樣本制備階段
樣本制備是整個(gè) PCR 反應(yīng)中為關(guān)鍵的環(huán)節(jié),在接收樣本時(shí)一定要確保樣本的密封性以及樣本編號(hào)的性。嚴(yán)格遵守操作規(guī)程進(jìn)行加樣操作,操作時(shí)候盡量少說話或者不說話。所有操作需要在生物柜內(nèi)進(jìn)行,操作前后生物柜需要進(jìn)行紫外燈,注意生物柜中物品的排放。戴手套并勤于更換,要有「無核酸觀念」 。
三、核酸擴(kuò)增
在核酸擴(kuò)增環(huán)節(jié)需要選擇質(zhì)量好的 Ep 管,裝入反應(yīng)體系的 EP 管上機(jī)前混勻、離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。在樣本檢測的同時(shí)設(shè)立對(duì)照(陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、陰性模板、試劑對(duì)照)。同時(shí)嚴(yán)密檢測 PCR 擴(kuò)增儀的各項(xiàng)性能指標(biāo),其中對(duì) PCR 擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
四、產(chǎn)物分析
常見問題:
1)無 CT 值出現(xiàn):模板量不足(雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況等)
2)CT 值出現(xiàn)過晚(大于 38):各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足
3)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性不佳:加樣誤差、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解等
4)陰性對(duì)照有信號(hào):模板有基因組的污染
5)擴(kuò)增效率低:反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解、反應(yīng)抑制
6)擴(kuò)增曲線的異常:模板的濃度太高或熒光染料的降解

公司正在出售的產(chǎn)品:


綿羊莫拉菌探針法熒光定量PCR試劑盒

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