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PCR試劑盒實驗步驟：
?準備階段?：
豬輪狀病毒D群染料法熒光定量RT-PCR在PCR管上做好標記，并將其置于冰上或低溫金屬塊上。
按照所使用的PCR酶說明書上的體系配制反應預混液。這是一種具有高特異性及優(yōu)良擴增性的高保真DNA聚合酶，適用于簡單或復雜模板、短片段或長片段的PCR擴增，并添加了單克隆抗體以在常溫條件下抑制DNA polymerase活性，允許在常溫下配制預混液。
配制反應液時，按照順序添加RNase free water、10×PCR Buffer、dNTP Mix、引物，后加入DNA聚合酶。注意模板需在模板區(qū)加入。
預變性處理?：
將待檢測的DNA樣品與緩沖液混合，加入引物和dNTPs，然后在適當?shù)臏囟认逻M行預變性處理，使DNA雙鏈解開。
PCR循環(huán)?：
加入DNA聚合酶和熒光染料，在變性、復性、延伸的溫度循環(huán)中完成DNA的擴增。
通過熒光信號的讀取和分析，得出待檢測DNA樣品的濃度和序列信息。
結(jié)果分析?：
PCR技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和高分辨率等優(yōu)點，能夠檢測出微量的DNA，并準確地檢測出DNA序列的變異和突變。
結(jié)果分析方法包括定量和相對定量，根據(jù)實驗需求選擇合適的方法進行分析。
整個實驗過程中，需要注意試劑的配制順序、酶的使用條件、模板的添加量以及引物的濃度，以確保實驗的準確性和可重復性。此外，實驗設(shè)計階段需要充分考慮實驗原理、操作流程、設(shè)備和試劑的選擇，以及實驗記錄的詳細性，這些都是保證實驗成功和結(jié)果可靠的關(guān)鍵因素?。
商品貨號
PR4137
英文名稱
Porcine rotavirus group E豬
商品名稱
豬輪狀病毒D群
產(chǎn)品分類
熒光定量PCR
規(guī)格
50T
包裝
盒裝
用途
僅供科研研究實驗
保存
-20℃避光
實驗流程：
1. 配制PCR反應體系：
- 模板DNA：10-100 ng（取決于模板的復雜性和豐度）
- 引物F（正向）：0.1-1.0 μM
- 引物R（反向）：0.1-1.0 μM
- dNTPs（混合的dATP、dCTP、dGTP、dTTP）：0.2 mM each
- 10×PCR緩沖液：1×
- MgCl2：1.5-2.5 mM（根據(jù)酶的要求調(diào)整）
- DNA聚合酶：0.5-2.5 U（根據(jù)酶的活性調(diào)整）
- 無菌去離子水：補足至總體積（通常為20-50 μL）
2. 設(shè)置PCR程序：
- 初始變性：95°C，3-5分鐘（激活聚合酶）
- 變性：95°C，15-30秒（每個循環(huán)）
- 退火：50-65°C，15-30秒（根據(jù)引物Tm調(diào)整）
- 延伸：72°C，30-60秒/kb（根據(jù)目標片段長度調(diào)整）
- 終延伸：72°C，5-10分鐘
- 保存：4°C
3. 執(zhí)行PCR：
- 將配制好的反應體系放入PCR儀器中，啟動程序。
4. 電泳分析：
- PCR結(jié)束后，取少量反應液進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以驗證擴增效果。
5. 結(jié)果判斷：
- 觀察電泳結(jié)果，目標條帶應清晰可見，無非特異性擴增。
PCR操作流程及注意事項：
一、試劑準備階段
試劑準備是 PCR 操作的個流程，需要在試劑貯存和準備區(qū)的超凈工作臺或生物柜進行，用確保無污染的移液器、槍頭及容器等進行分裝。所有的 PCR 體系都應該在 - 20℃ 保存，除了 ddH2O 之外，其余的試劑組份需完全融化之后再加入，以免影響濃度。配制反應體系應在快速進行，以減少非特異性擴增。體系配制完成之后應馬上進行 PCR 反應。
二、樣本制備階段
樣本制備是整個 PCR 反應中為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，在接收樣本時一定要確保樣本的密封性以及樣本編號的性。嚴格遵守操作規(guī)程進行加樣操作，操作時候盡量少說話或者不說話。所有操作需要在生物柜內(nèi)進行，操作前后生物柜需要進行紫外燈，注意生物柜中物品的排放。戴手套并勤于更換，要有「無核酸觀念」 。
三、核酸擴增
在核酸擴增環(huán)節(jié)需要選擇質(zhì)量好的 Ep 管，裝入反應體系的 EP 管上機前混勻、離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。在樣本檢測的同時設(shè)立對照（陽性對照、陰性對照、陰性模板、試劑對照）。同時嚴密檢測 PCR 擴增儀的各項性能指標，其中對 PCR 擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
四、產(chǎn)物分析
常見問題：
1）無 CT 值出現(xiàn)：模板量不足（雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況等）
2）CT 值出現(xiàn)過晚（大于 38）：各種反應成分的降解或加樣量的不足
3）標準曲線線性相關(guān)性不佳：加樣誤差、標準品出現(xiàn)降解等
4）陰性對照有信號：模板有基因組的污染
5）擴增效率低：反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解、反應抑制
6）擴增曲線的異常：模板的濃度太高或熒光染料的降解
公司正在出售的產(chǎn)品：
人ACTB基因PCR檢測試劑盒（熒光PCR法）
Human Immunodeficiency Virus 1(HIV1MA)1MARTPCR
酵母菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒
Human Tcell Lymphoma Virus Provirus (HTLV)TPCR
艾特韋病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Infectious Bronchitis Virus(IBV)RTPCR
牛巨細胞病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
Influenza Virus CRTPCR
禽痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
Junin Virus(JUNV)RTPCR
禽腎炎病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Lactobacillus salivariusPCR
申克孢子探針法熒光定量PCR試劑盒
Leishmania majorPCR
水痘-帶狀皰疹病毒野生株探針法熒光定量PCR試劑盒
Leucocytozoon spp.PCR
人副流感病毒4A型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Trichomonas stableriPCR
人類嗜T細胞病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Mouse Leukemia Virus(MLV)RTPCR
禽傳染性管炎病毒疫苗株探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Machupo Virus(MACV)RTPCR
禽傳染性管炎病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Malleomyces malleiPCR
變異變形桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒
豬輪狀病毒D群染料法熒光定量RT-PCRMarteilia spp.PCR
皮炎外瓶霉探針法熒光定量PCR試劑盒
Microsporum gypseumPCR
牛皮蠅蛆探針法熒光定量PCR試劑盒
Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA)PCR