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PCR反應(yīng)條件控制
日期：2025-05-20 20:22
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摘要：
PCR反應(yīng)條件控制：
1、PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2、鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3、底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 μmol/L。
4、TaqDNA聚合酶2.5U(100 μl）。
5、引物濃度一般為0.1 ～0.5 μmol/L。
6、反應(yīng)溫度
a. 變性溫度和時(shí)間95℃，30s。
b. 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。
c. 延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
d. Tm值=4(G+C) +2(A+T...
PCR反應(yīng)條件控制：
1、PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2、鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3、底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 μmol/L。
4、TaqDNA聚合酶2.5U(100 μl）。
5、引物濃度一般為0.1 ～0.5 μmol/L。
6、反應(yīng)溫度
a. 變性溫度和時(shí)間95℃，30s。
b. 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃。
c. 延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
d. Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7、循環(huán)次數(shù)：一般為25～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。