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商品貨號
PR3463
英文名稱
Mycoplasma dispar
商品名稱
差異支原體
產(chǎn)品分類
熒光定量PCR
規(guī)格
50T
包裝
盒裝
用途
僅供科研研究實驗
保存
-20℃避光
PCR操作流程及注意事項：
一、試劑準備階段
試劑準備是 PCR 操作的個流程，需要在試劑貯存和準備區(qū)的超凈工作臺或生物柜進行，用確保無污染的移液器、槍頭及容器等進行分裝。所有的 PCR 體系都應該在 - 20℃ 保存，除了 ddH2O 之外，其余的試劑組份需完全融化之后再加入，以免影響濃度。配制反應體系應在快速進行，以減少非特異性擴增。體系配制完成之后應馬上進行 PCR 反應。
二、樣本制備階段
樣本制備是整個 PCR 反應中為關鍵的環(huán)節(jié)，在接收樣本時一定要確保樣本的密封性以及樣本編號的性。嚴格遵守操作規(guī)程進行加樣操作，操作時候盡量少說話或者不說話。所有操作需要在生物柜內(nèi)進行，操作前后生物柜需要進行紫外燈，注意生物柜中物品的排放。戴手套并勤于更換，要有「無核酸觀念」 。
三、核酸擴增
在核酸擴增環(huán)節(jié)需要選擇質(zhì)量好的 Ep 管，裝入反應體系的 EP 管上機前混勻、離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。在樣本檢測的同時設立對照（陽性對照、陰性對照、陰性模板、試劑對照）。同時嚴密檢測 PCR 擴增儀的各項性能指標，其中對 PCR 擴增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
四、產(chǎn)物分析
常見問題：
1）無 CT 值出現(xiàn)：模板量不足（雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況等）
2）CT 值出現(xiàn)過晚（大于 38）：各種反應成分的降解或加樣量的不足
3）標準曲線線性相關性不佳：加樣誤差、標準品出現(xiàn)降解等
4）陰性對照有信號：模板有基因組的污染
5）擴增效率低：反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解、反應抑制
6）擴增曲線的異常：模板的濃度太高或熒光染料的降解
實驗流程：
1. 配制PCR反應體系：
- 模板DNA：10-100 ng（取決于模板的復雜性和豐度）
- 引物F（正向）：0.1-1.0 μM
- 引物R（反向）：0.1-1.0 μM
- dNTPs（混合的dATP、dCTP、dGTP、dTTP）：0.2 mM each
- 10×PCR緩沖液：1×
- MgCl2：1.5-2.5 mM（根據(jù)酶的要求調(diào)整）
- DNA聚合酶：0.5-2.5 U（根據(jù)酶的活性調(diào)整）
- 無菌去離子水：補足至總體積（通常為20-50 μL）
2. 設置PCR程序：
- 初始變性：95°C，3-5分鐘（激活聚合酶）
- 變性：95°C，15-30秒（每個循環(huán)）
- 退火：50-65°C，15-30秒（根據(jù)引物Tm調(diào)整）
- 延伸：72°C，30-60秒/kb（根據(jù)目標片段長度調(diào)整）
- 終延伸：72°C，5-10分鐘
- 保存：4°C
3. 執(zhí)行PCR：
- 將配制好的反應體系放入PCR儀器中，啟動程序。
4. 電泳分析：
- PCR結(jié)束后，取少量反應液進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以驗證擴增效果。
5. 結(jié)果判斷：
- 觀察電泳結(jié)果，目標條帶應清晰可見，無非特異性擴增。
PCR試劑盒實驗步驟：
?準備階段?：
差異支原體染料法熒光定量PCR在PCR管上做好標記，并將其置于冰上或低溫金屬塊上。
按照所使用的PCR酶說明書上的體系配制反應預混液。例如，使用艾科瑞生物的AG12204，這是一種具有高特異性及優(yōu)良擴增性的高保真DNA聚合酶，適用于簡單或復雜模板、短片段或長片段的PCR擴增，并添加了單克隆抗體以在常溫條件下抑制DNA polymerase活性，允許在常溫下配制預混液。
配制反應液時，按照順序添加RNase free water、10×PCR Buffer、dNTP Mix、引物，后加入DNA聚合酶。注意模板需在模板區(qū)加入。
預變性處理?：
將待檢測的DNA樣品與緩沖液混合，加入引物和dNTPs，然后在適當?shù)臏囟认逻M行預變性處理，使DNA雙鏈解開。
PCR循環(huán)?：
加入DNA聚合酶和熒光染料，在變性、復性、延伸的溫度循環(huán)中完成DNA的擴增。
通過熒光信號的讀取和分析，得出待檢測DNA樣品的濃度和序列信息。
結(jié)果分析?：
PCR技術具有高靈敏度、高特異性和高分辨率等優(yōu)點，能夠檢測出微量的DNA，并準確地檢測出DNA序列的變異和突變。
結(jié)果分析方法包括定量和相對定量，根據(jù)實驗需求選擇合適的方法進行分析。
整個實驗過程中，需要注意試劑的配制順序、酶的使用條件、模板的添加量以及引物的濃度，以確保實驗的準確性和可重復性。此外，實驗設計階段需要充分考慮實驗原理、操作流程、設備和試劑的選擇，以及實驗記錄的詳細性，這些都是保證實驗成功和結(jié)果可靠的關鍵因素?。
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